La technologie d’analyse par Complémentation de Fragment d’Enzyme (EFC)

La technologie brevetée de DiscoveRx de Complémentation de Fragment d’Enzyme offre à la recherche de drogue les moyens de caractériser des réactions biomoléculaires pour poursuivre des programmes thérapeutiques de recherche de drogue ou de criblage avec une technologie d’analyse fiable et sûre, utilisant des composés biochimiques ou basée sur des cellules intègres.

Un signal fiable et reproductible:
EFC est un signal amplifié enzymatiquement, conduisant à un ratio signal sur bruit très élevé et d’une grande précision (facteur Z’= 0,7).

Des interférences minimisées :
La chimioluminescence minimise les interférences avec la librairie de composés, n’introduisant aucun signal artificiel dut à une

Des protocoles simples:
Des protocoles simples comprenant, l’addition de réactifs, leur mélange et la lecture, facilite leur automatisation. Les analyses EFC ne nécessitent pas de lavage, de centrifugation.

Pratique:
Utilisez vos appareils déjà présents dans votre laboratoire, aucun investissement particulier ne sera nécessaire. Vous pourrez utiliser votre robot fixation aspécifique de billes ou de marqueurs secondaires.

Flexibilité:
Les protocoles sont miniaturisable au format microplaque 96, 384 et 1536 puits, engendrant une réduction des coûts importante. de pipetage, un large éventail de luminomètre, des lecteurs de microplaque et des caméras CCD.

Réduction des coûts:
L’excellente reproductibilité et les faibles variations lot à lot permettent d’optimiser les réactifs, réduisant ainsi significativement le coût à l’analyse.

Donneur d’Enzyme (ED), Marqueur EFC
ED est un petit peptide (4-11KD) non isotopique, n’utilisant pas de bille marquée dans le cadre du système d’analyse EFC. Il peut-être soit chimiquement conjugué pour des immunoanalyses compétitives In Vitro sur des composés biochimiques ou bien exprimé par recombinaison dans des cellules comme une protéine de fusion (Pro Label) pour mesurer la translocation et l’expression protéique. Quand il est exprimé seul, le Pro Label est instable et se retrouve rapidement dégradé, ce qui réduit significativement le bruit de fond.

Comme un marqueur, l'ED est un petit peptide qui peut être attaché par covalence ou exprimé avec une variété de petites molécules ou protéines sans changer leurs propriétés et leurs fonctions. Parce que ED est un peptide sans conformation tridimensionnelle, il n’y a aucune restriction de taille ou de poids moléculaire pour ce qui est couplé à ED.

Accepteur d’Enzyme (EA), Enzyme inactive EFC pour la détection
Accepteur d’Enzyme (EA), Enzyme inactive EFC pour la détection
EA est une enzyme ß-gal inactive. C’est une forme inactive car elle est dépourvue des acides aminés correspondant au peptide ED. En solution, EA peut rapidement se recombiner avec l'ED ou des protéines de fusion de type Pro Label grâce à un processus appelé complémentation pour former une enzyme active ß-gal EFC.

L’enzyme EFC active et son substrat pour la détection
ß-galactosidase (E.C. 3.2.1.23) hydrolyse spécifiquement et de manière reproductible de nombreux substrats. Puisque l'enzyme active d'EFC -galactosidase est comparable à l'activité de l'enzyme ß-galactosidase native, elle hydrolyse les substrats spécifiques pour produire un signal détectable par une variété de lecteurs de microplaque - colorimétriques, d'intensité fluorescente, de luminomètres, de lecteurs à plusieurs modes de fonctionnement et de caméras CCD. Les analyses EFC et les solutions liées à l’EFC sont préférentiellement développées en utilisant le substrat de chimioluminescence lequel produit un signal de forte intensité avec un faible bruit de fond car elle n’est pas affecté par la fluorescence naturelle des composés.

Le format In Vivo EFC cellules entières pour l’expression de protéines
La technologie EFC de détection peut-être adaptée In Vivo, en utilisant un vecteur d’expression pour cloner un gène d’intérêt qui sera par la suite transfecté dans une lignée cellulaire exprimant ED, protéine de fusion dénommée ProLabel.
Les lysats des lignées cellulaires exprimant le ProLabel sont mesurés en utilisant la technologie EFC par addition de EA et du substrat.

Le format In Vivo PathHunter™ EFC pour les cellules entières pour la translocation
PathHunter™ comble le fossé entre le criblage à haut débit (HTS) et le High content analysis (HCA), en appliquant la complémentation EFC aux cellules entières grâce à un système de détection In Vivo. La famille de produits PathHunter™ est un système de cellules intègres qui utilise la « géolocalisation » dans un environnement de cellules vivantes pour étudier la translocation de cibles.

EA et ED peuvent être co-exprimés dans la cellule pour mesurer la translocation nucléaire. EA est spécifiquement localisé dans le noyau grâce à une construction NLS, tandis que la protéine de fusion native, ProLabel, maintient dans le cytoplasme la protéine de fusion cible. La « géocomplémentation » apparaît seulement quand le ProLabel de fusion se transfère dans le noyau en réponse à un stimuli extérieur. Donc la technologie EFC PathHunter™ fournit les moyens de rechercher les voies cellulaires résultant de la translocation. Par conséquent les analyses PathHunter™ ne nécessite pas de technologie d’imagerie, les analyses sont possible sur tout les robots de pipetage pour un accroissement de votre débit dans un environnement de cellules entières en utilisant simplement les appareils de pipetage et les lecteurs de microplaques déjà présent dans tout les programmes de recherche.

Les analyses de cellules intègres et des cibles utilisant la technologie EFC sont dénommées comme PathHunter™ et peuvent dès à présent couvrir les applications suivantes :

• La translocation des protéines
• L’expression des protéines